De toepassing van real-time RT-PCR in Covid-19

Wat is realtime RT-PCR?

Het toevoegen van fluorescerende genen aan het PCR-reactiesysteem, met behulp van accumulatie van fluorescentiesignalen om het hele PCR-proces in realtime te volgen, en vervolgens het onbekende sjabloon kwantificeren via een standaardcurve, wordt real-time fluorescentie kwantitatieve PCR-technologie genoemd, ook bekend als real-time Q -PCR.

Het principe van PCR-amplificatie is hetzelfde als dat van een gewoon PCR-instrument, behalve dat de primers die tijdens PCR-amplificatie worden toegevoegd, worden gelabeld met isotopen, fluoresceïne, enz., En de primers en fluorescente sondes worden gebruikt om specifiek te binden aan de template voor amplificatie bij dezelfde tijd.

De versterkte resultaten worden verzameld en verzonden naar het computeranalyse- en verwerkingssysteem via het real-time verzamelsignaal van het fluorescentiesignaalverzamelsysteem om een ​​kwantitatieve real-time resultaatuitvoer te verkrijgen.

RT-PCR in real time is een van de meest gebruikte laboratoriummethoden voor het detecteren van het COVID-19-virus. Hoewel veel landen real-time RT-PCR hebben gebruikt voor het diagnosticeren van andere ziekten, zoals het ebolavirus en het zikavirus, hebben velen ondersteuning nodig bij het aanpassen van deze methode voor het COVID-19-virus en bij het vergroten van hun nationale testcapaciteiten.

Hoe werkt realtime RT-PCR met het COVID-19-virus?

Een monster wordt verzameld uit de delen van het lichaam waar het COVID-19-virus zich verzamelt, zoals de neus of keel van een persoon. Het monster wordt behandeld met verschillende chemische oplossingen die stoffen zoals eiwitten en vetten verwijderen en die alleen het in het monster aanwezige RNA extraheren. Dit geëxtraheerde RNA is een mix van het eigen genetische materiaal van de persoon en, indien aanwezig, het RNA van het virus.

Het RNA wordt met behulp van een specifiek enzym reverse getranscribeerd naar DNA. Wetenschappers voegen vervolgens extra korte DNA-fragmenten toe die complementair zijn aan specifieke delen van het getranscribeerde virale DNA. Als het virus in een monster aanwezig is, hechten deze fragmenten zich aan doelwitsecties van het virale DNA. Sommige van de toegevoegde genetische fragmenten worden gebruikt voor het bouwen van DNA-strengen tijdens amplificatie, terwijl de andere worden gebruikt voor het bouwen van DNA en het toevoegen van markeringslabels aan de strengen, die vervolgens worden gebruikt om het virus te detecteren.

Het mengsel wordt vervolgens in een RT-PCR-machine geplaatst. De machine doorloopt temperaturen die het mengsel verwarmen en koelen om specifieke chemische reacties te veroorzaken die nieuwe, identieke kopieën van de doelsecties van viraal DNA creëren. De cyclus wordt keer op keer herhaald om door te gaan met het kopiëren van de doelsecties van viraal DNA. Elke cyclus verdubbelt het vorige aantal: twee exemplaren worden vier, vier exemplaren worden acht, enzovoort. Een standaard real-time RT-PCR-opstelling doorloopt meestal 35 cycli, wat betekent dat tegen het einde van het proces ongeveer 35 miljard nieuwe kopieën van de secties viraal DNA worden gemaakt van elke streng van het virus in het monster .

Terwijl nieuwe kopieën van de virale DNA-secties worden gebouwd, hechten de markeringslabels zich aan de DNA-strengen en geven ze vervolgens een fluorescerende kleurstof af, die wordt gemeten door de computer van de machine en in realtime op het scherm wordt weergegeven. De computer volgt de hoeveelheid fluorescentie in het monster na elke cyclus. Wanneer een bepaald fluorescentieniveau wordt overschreden, bevestigt dit dat het virus aanwezig is. Wetenschappers houden ook bij hoeveel cycli er nodig zijn om dit niveau te bereiken om de ernst van de infectie te schatten: hoe minder cycli, hoe ernstiger de virale infectie.

Waarom realtime RT-PCR gebruiken?

De realtime RT-PCR-techniek is zeer gevoelig en specifiek en kan binnen drie uur een betrouwbare diagnose stellen, hoewel laboratoria gemiddeld tussen de zes en acht uur in beslag nemen. Vergeleken met andere beschikbare virusisolatiemethoden, is real-time RT-PCR aanzienlijk sneller en heeft het een kleinere kans op besmetting of fouten, aangezien het hele proces in een gesloten buis kan worden uitgevoerd. Het blijft de meest nauwkeurige methode die beschikbaar is voor de detectie van het COVID-19-virus.

Realtime RT-PCR kan echter niet worden gebruikt om infecties uit het verleden op te sporen, wat belangrijk is om de ontwikkeling en verspreiding van het virus te begrijpen, aangezien virussen slechts gedurende een bepaald tijdsvenster in het lichaam aanwezig zijn. Andere methoden zijn nodig om infecties uit het verleden op te sporen, op te sporen en te bestuderen, met name die welke zich zonder symptomen kunnen hebben ontwikkeld en verspreid.